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心得體會(huì):組織樣本的western blot,這十點(diǎn)需要注意

2021-04-28 [2158]
利用組織樣本來進(jìn)行Western blot,這是許多實(shí)驗(yàn)室常常開展的工作。不過,若是想獲得重復(fù)可靠的印跡結(jié)果,也絕非易事。在此,Bio-Rad的專家貢獻(xiàn)了一些經(jīng)驗(yàn),可以幫助您獲得清晰的圖像和可靠的數(shù)據(jù)。
1. 快速處理組織
使用干凈的工具來收集和處理組織樣本。為了去除可能影響蛋白穩(wěn)定性的污染物,用預(yù)冷的中性緩沖液簡單洗滌。洗滌后,在液氮中快速冷凍組織,以便保留蛋白的結(jié)構(gòu)和特征,比如翻譯后修飾(PTM)。組織樣本可保存在冰上,立即勻漿處理。若保存在 –20°C,蛋白仍然有可能降解,因此組織樣本要放在–80°C長期保存。
2. 精心挑選裂解液
在選擇jia的裂解緩沖液時(shí),應(yīng)考慮pH值、離子強(qiáng)度、去污劑和變性劑類型等因素。放射免疫沉淀分析緩沖液(RIPA)是廣泛使用的裂解液。同時(shí),在選擇過程中也要考慮目標(biāo)蛋白的定位,例如,細(xì)胞質(zhì)蛋白建議選用Tris-HCl裂解液,而核蛋白則首xuan RIPA。在富集各個(gè)組分的低豐度蛋白時(shí),可能需要對(duì)組織組分進(jìn)行預(yù)先分離。裂解液的用量取決于組織的大小/重量;緩沖液與組織的比例對(duì)確保有效裂解很關(guān)鍵。
3. 選擇破碎方法
與細(xì)胞相比,組織需要更劇烈的破碎方法,如勻漿技術(shù)。為了進(jìn)一步解離組織并剪切細(xì)胞DNA,可能需要對(duì)樣本進(jìn)行超聲處理。這一步要避免起泡,因?yàn)樗鼤?huì)降低回收率。同時(shí),脂質(zhì)會(huì)影響western blot的質(zhì)量,要盡量去除。從植物組織中提取蛋白也頗具挑戰(zhàn)性,因?yàn)樗鼈兏缓鞍酌福€含有大量可能干擾蛋白提取的代謝物。您必須針對(duì)特定的植物組織來優(yōu)化提取過程。
4. 抑制蛋白降解
細(xì)胞膜的破壞會(huì)釋放出可降解蛋白質(zhì)的酶。為了限制蛋白酶的活性,可以向緩沖液中加入尿素等強(qiáng)變性劑,不過這些條件可能會(huì)影響某些蛋白質(zhì)的完整性,因此,裂解液中通常含有蛋白酶抑制劑混合物。常用的蛋白酶抑制劑包括PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽和胃蛋白酶抑制劑。
SUMO化蛋白的鑒定可能特別有難度,因?yàn)槿コ齋UMO的異肽酶存在,并且通常只有一小部分蛋白被SUMO化。為了保留SUMO化,建議在裂解液中加入異肽酶抑制劑。去泛素化酶(DUB)的存在也會(huì)去除泛素結(jié)合物。因此,必須向細(xì)胞裂解液中加入EDTA或EGTA,以及dian乙酰胺(IAA)或N-乙基馬來酰亞胺(NEM)。IAA和NEM的使用濃度通常為5-10 mM。不過,某些蛋白可能需要更高的濃度,比如IRAK1。
5. 定量您的樣本
測定樣本濃度,可確保每塊凝膠的上樣量相同,并方便比較各個(gè)樣本之間的蛋白水平差異,比如處理和未處理樣本,或?qū)嶒?yàn)各個(gè)階段的樣本。您可以采用Bradford分析來進(jìn)行總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化。不過,如果樣本中包含不可溶和可溶蛋白,則Bradford方法不可靠,再次強(qiáng)調(diào)了均質(zhì)化的重要性。
6 驗(yàn)證蛋白上樣
根據(jù)您的蛋白在細(xì)胞中處于哪個(gè)位置,可選擇jia的上樣對(duì)照。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白,常用的對(duì)照是看家蛋白β-肌動(dòng)蛋白或β-微管蛋白;對(duì)于核蛋白,通常使用組蛋白H1或組蛋白H3。不過,近年來許多研究表明常用的看家蛋白不適合蛋白的歸一化,強(qiáng)調(diào)生理和病理因素可能影響它們的表達(dá)水平。另一個(gè)問題是看家蛋白往往超出了檢測的動(dòng)態(tài)范圍。
7. 選擇合適的膜
蛋白質(zhì)可轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜的機(jī)械強(qiáng)度更高,特別適合膜的剝離和再次結(jié)合。PVDF膜是疏水性的,需要在甲醇中預(yù)浸泡。NC膜的信噪比高,不需要甲醇預(yù)處理。需要注意的是,NC膜不能與含有SDS的轉(zhuǎn)移緩沖液一起使用。在選擇轉(zhuǎn)印膜時(shí),您可能還需要考慮其他參數(shù),比如孔徑。
8. 降低內(nèi)源背景
在對(duì)組織裂解物進(jìn)行western blot檢測時(shí),內(nèi)源IgG的信號(hào)和非特異性二抗結(jié)合可能會(huì)掩蓋低豐度的蛋白或某種分子量的蛋白。~50 kD和~25 kD的蛋白尤其需要注意,它們可能被變性IgG的重鏈和輕鏈所掩蓋。對(duì)于胸腺或甲狀腺等組織,這個(gè)問題尤為明顯,因?yàn)樗鼈兒写罅康膬?nèi)源IgG。
9. 采用適當(dāng)?shù)膶?duì)照
為了確保一抗的特異性,必須使用陽性和陰性的組織對(duì)照。對(duì)于陽性對(duì)照,使用已知表達(dá)高水平目標(biāo)蛋白的組織。推薦的陰性對(duì)照包括僅使用二抗(省略一抗孵育步驟)以及已知不表達(dá)目標(biāo)蛋白的組織樣本。此外,疾病狀態(tài)下特定蛋白質(zhì)的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)差異。為了解釋這些差異,hao使用健康組織和疾病組織的樣本。
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