血清蛋白醋酸纖維原理及操作

原理
膠體顆粒在一定條件下可以帶有電荷，帶有電荷的膠體顆粒又可以借靜電吸引力在電場中泳行，帶正電荷者泳向負極，帶負電荷者泳向正極，此種現(xiàn)象稱為電泳。
血清中各種蛋白質都有它*的等電點。各種蛋白質在各自的等電點時呈電中性狀態(tài)，它的分子所帶正電荷量與所帶負電荷量相等。將蛋白質置于比其等電點較高的PH緩沖液中，它們將形成帶負電荷質點，在電場中均向正極泳動。由于血清中各種蛋白質的等電點不同，帶電荷量多少有差異，蛋白質的分子量大小也不同，所以在同一電場中泳動速度也不同。蛋白質分子小帶電荷多，泳動速度快；分子大而帶電荷少，泳動較慢。血清蛋白在PH8.6的巴比妥緩沖液中進行電泳，按其泳動速度可以分出以下的主要區(qū)帶，從正起依次為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白等區(qū)帶。
操作
1． 醋纖膜剪成2×8㎝大小，用鉛筆在一端標號；
2． 電泳液：巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（稱取巴比妥2.21克，巴比妥鈉12.36克，溶于1000ml水中）；
3． 醋纖膜浸于電泳液中20min左右，夾于潔凈濾紙中，吸去多余的緩沖液；
4． 將醋纖膜毛面向上貼于電泳槽支架上拉直，用邊緣整齊的玻片沾取少量無溶血血清，按壓于醋纖膜標號一端約2㎝處，注意與膜的邊緣保持一定距離，待血清滲入膜后，濾紙上吸去多余血清；
5． 反轉醋纖膜，使光面朝上貼于電泳槽中紗布兩端，使其自然充滿緩沖液，稍待片刻；
6． 接通電源，注意正負極切勿接錯，電壓90～150V，電流0.4～0.6mA/㎝，通電45分鐘（冬季時間稍長60min）；
7． 關閉電源，取出醋纖膜染色；
8． 染色：氨基黑10b染色液（稱取氨基黑10B0.1克，溶于無水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml溶解；另取磺基水楊酸2.5克，溶于74.5ml水中；將二者混合搖勻即可）染色8min；
9． 漂洗：漂洗液（甲醇45ml、冰醋酸5ml與水50ml混勻）中漂去多余的染料，直至背景無色為止；
10． 洗脫，將漂洗干凈的醋纖膜吸干，剪下各染色的蛋白區(qū)帶放入相應的試管中，同時剪下與白蛋白寬度相當?shù)目瞻讌^(qū)帶作空白對照，在白蛋白管內加0.4mol/L氫氧化鈉6ml（吸光度值×2），其余各管中加入3ml，振搖數(shù)次，置于37℃水溫箱中20min，使其染料浸出；
11． 比色：620nm處讀取各管吸光度值，然后計算出各自的含量；
12． 計算：吸光度值相加得總和，然后計算各自的吸光度值所占總吸光度值的百分比即為各自蛋白質的百分含量；